Réactifs de préparation de librairies pour ADN tumoral circulant et germinal apparié

Fourniture complète, par un fournisseur unique, des réactifs nécessaires à la préparation de librairies et à l'enrichissement par capture avant séquençage haut débit sur NovaSeq 6000 ou équivalent. La solution couvre simultanément l'ADN tumoral circulant extrait de plasmas ou autres liquides biologiques sur tubes avec préservateur, après double centrifugation, et l'ADN germinal apparié extrait de culots globulaires.

L'approche doit permettre la détection des SNV jusqu'à une fréquence allélique de 0,15 %, ainsi que des fusions et réarrangements, MSI, amplifications, délétions, CNV et SV. Les UMI doivent être combinés aux UDI afin d'améliorer la détection des variants de faible fréquence. La chimie doit limiter le bruit de fond et assurer une couverture homogène et optimale pour les CNV et SV. La solution doit être robuste avec un input de 2 ng d'ADN tumoral circulant, avec données expérimentales à l'appui et évaluation lors des essais.

Panels, activité et multiplexage

Deux formats sont concernés : un panel ciblé de 290 kb et un panel large de 1,42 Mb. L'activité prévisionnelle est de 2 500 patients par an, soit 5 000 librairies : 2 500 librairies d'ADN tumoral circulant et 2 500 librairies d'ADN germinal apparié. Elle se répartit entre 90 % de panels ciblés, soit 2 250 patients et 4 500 librairies, et 10 % de panels larges, soit 250 patients et 500 librairies. Une progression d'environ 15 % par an est anticipée.

En cas de pooling pré-capture, le multiplexage doit être identique pour les deux types d'ADN, par pools de 8. L'offre financière doit permettre l'analyse simultanée de 24 patients, soit 48 librairies. Le fournisseur doit fournir des plaques d'indexage d'au moins 96 UDI, en précisant le format et, le cas échéant, la disponibilité de 384 index.

Automatisation et documentation technique

La préparation automatisée est obligatoire sur automates Hamilton VANTAGE pour les étapes pré-capture et Hamilton STAR pour les étapes post-capture. Le titulaire garantit la compatibilité du kit avec ces équipements et fournit un protocole automatisé détaillé ainsi que les coordonnées de laboratoires français ou européens utilisant ces kits en routine sur Hamilton.

La réponse précise notamment les adaptations éventuelles entre ADN tumoral circulant et ADN germinal apparié, la possibilité d'utiliser un même deck, la fragmentation, les cycles de PCR, la stratégie d'enrichissement, les méthodes de dosage et de concentration, les temps opératoires pour 96 échantillons, les conditions de stockage, les réactifs à reconstituer, le volume mort et les possibilités de conservation des reliquats. Les conditionnements disponibles doivent être indiqués parmi 24, 48, 96 ou 384 tests.

La réponse précise le statut CE IVD et/ou CE-IVDR ou RUO de chaque solution, les UMI, leur taille, leur position et les modalités de démultiplexage. Elle comprend les fiches techniques et les FDS de chaque réactif, ainsi que les conditions d'élimination.

Approvisionnement, évolution et accompagnement

Le fournisseur garantit la disponibilité des kits pendant toute la durée du marché, reconductions comprises, sans rupture de stock excédant 8 jours. En cas d'arrêt de commercialisation ou d'évolution, la solution de remplacement doit respecter les mêmes conditions tarifaires au maximum ainsi que les exigences réglementaires, techniques et d'automatisation. Un préavis d'au moins un an est requis.

Les évolutions imposées comprennent la mise à jour du protocole sur automate, les réactifs nécessaires aux validations de méthode et la formation du personnel. L'actualisation annuelle des panels ciblés et larges jusqu'à 10 % de leur taille initiale est incluse dans l'offre. Le design doit être revu et validé par les biologistes avant production. Chaque nouveau lot fait l'objet d'une validation sur site ; l'optimisation nécessaire et le remplacement d'un lot non conforme sont pris en charge par le fournisseur.

Le titulaire assure la formation sur site d'au moins 8 utilisateurs et remet une attestation utilisable pour l'habilitation ou le maintien des compétences selon l'EN ISO 15189. Il détaille les formations utilisateurs et experts, l'accompagnement de la préparation des librairies jusqu'au séquençage, le support technique, le traitement des incidents et les délais de réponse.

Les kits doivent présenter une durée de péremption garantie d'au moins 6 mois à la livraison. Le fournisseur indique les délais d'approvisionnement, les sites de fabrication et logistiques, ainsi que les modalités de tracking des commandes, du transport et de la température à réception.

Essais, contrôles et livrables analytiques

Des essais peuvent être réalisés pour évaluer la performance analytique. Ils portent sur 48 échantillons de référence, comprenant 32 ADN tumoraux circulants et 16 ADN germinaux appariés, représentatifs des SNV, CNV, SV et MSI, sur la base du BED ciblé à façon de 290 kb. Le fournisseur prépare et renvoie les librairies dans un délai de 60 jours à compter de la réception des échantillons, obligatoirement sur une plateforme européenne, à ses frais, y compris la synthèse des panels à façon et les kits de préparation.

Les pools initiaux de capture sont constitués par 8 échantillons. Le fournisseur renvoie également un tube prêt à être séquencé regroupant ces pools, normalisé à 10 nM dans 60 µL, permettant les profondeurs cibles de 30 000X pour l'ADN tumoral circulant et 1 000X pour l'ADN germinal apparié. Il précise le nombre de clusters nécessaire pour un séquençage 2 × 150 sur flowcell NovaSeq S4, référence Illumina 20028312.

Les livrables d'essai comprennent :

• Le sample sheet de correspondance entre index et échantillons, avec indication du reverse-complement éventuel.
• La description des UMI, des dark bases, du masque de démultiplexage et des informations nécessaires aux pipelines internes des HCL.
• Le protocole détaillé utilisé et les adaptations entre ADN tumoral circulant et ADN germinal apparié.
• Le BED exact du panel produit et la liste des régions du BED de test non couvertes.

Les vérifications quantitatives et qualitatives sont effectuées à la livraison. Les fournitures non conformes peuvent être refusées totalement ou partiellement, remplacées immédiatement ou acceptées avec réfaction. Les produits doivent conserver au moins les deux tiers de leur validité totale lorsqu'elle est inférieure à un an, ou au moins un an dans les autres cas. Les kits de librairies défectueux doivent être remplacés sans frais.