Analyses métagénomiques et métabarcoding d'ADN de sols

Méthodes et protocoles analytiques

• Métabarcoding sur 5 marqueurs avec exigences techniques précises (amorce, taille approximative d'amplicon et profondeur minimale souhaitée) :
  • Protistes (Cercozoaires) — 18S rRNA V4 — amorces S616F_Cerco / S616F_Eocer - S963R_Cerco ou S947R_Cerco — ~350 pb — profondeur > 60 000 reads.
  • Champignons — 18S rRNA V7–V8 — amorces FR1 - FF390 — ~385 pb — profondeur > 60 000 reads.
  • Archées — SSU V1–V2 — SSU1ArF - SSU520R — ~519 pb — profondeur > 60 000 reads.
  • Procaryotes (Bactéries) — 16S rRNA V4–V5 — F479 - R888 — ~410 pb — profondeur > 60 000 reads.
  • Eucaryotes (Nématodes) — 18S rRNA V4 — 3NDf - 1132r — ~570 pb — profondeur > 60 000 reads.
• qPCR : estimation du ratio ADN bactérien / ADN fongique pour l'ensemble des 640 extraits (forfait unique). Procédure qPCR à détailler (amplification, standards, courbes, contrôles, réplicas, seuils de quantification/limite de détection).
• Le titulaire doit décrire complètement la procédure d'élaboration des librairies (pré‑amplification si nécessaire, indices/barcoding, normalisation), les contrôles inclus (techniques, négatifs, positifs, réplicas analytiques, spike‑ins éventuels) et les modalités de séquençage.

Profondeur de séquençage, contrôles et reprise

• Respect des profondeurs minimales indiquées par marqueur ; proposition d'une profondeur finale adaptée à la fois technique et économique.
• Modalités de contrôle qualité à fournir : seuils d'acceptation, gestion des échantillons hors spécification, procédure de reprise en cas de non‑conformité.

Bioinformatique et données remises

• Chaîne complète incluse : retrait des amorces, démultiplexage, nettoyage, assemblage/alignement, filtrage, assignement taxonomique. L'approche ASV est privilégiée ; justification et détails des choix logiciels et bases de référence à fournir.
• Remise des données brutes (.fastq forward et reverse séparés par amorce et par échantillon) et des données traitées (tables ASV/OTU .xlsx, table des séquences propres avec assignements taxonomiques).

Livrables exigés

• Rapport méthodologique et synthétique (.pdf et .docx) comprenant protocoles détaillés, contrôle qualité, limites de la méthode et représentations graphiques/tableaux des résultats.
• Fichiers bruts .fastq et fichiers traités, tables ASV/OTU par échantillon (.xlsx).
• Détail des prestations facturées selon postes (préparation librairies par groupe de marqueurs, qPCR ratio, bioinformatique, rapport, partage de fichiers).